Sychu Vagrau"r Gwningen R. W. J. MEREDITH, R. B. KEMP a I. AP GWYNN MAE'R mwyafrif o gwmnïau sy'n cynhyrchu defnyddiau coluro, fferyllol neu amaethyddol yn prysur geisio gwella eu harbrofion in vitro er mwyn lleihau'r nifer o anifeiliaid a ddefnyddir ar gyfer mesur effeithiau gwenwynig posibl eu cynnyrch. Bu pwysau llywodraethol i symud i'r cyfeir- iad hwn oherwydd y farn gyhoeddus ar gamddefnyddio anifeiliaid. Mae yna resymau economaidd hefyd gan fod anifeiliaid yn gostus iawn i'w cadw ac i'w defnyddio mewn arbrofion. Byddai datblygu dulliau newydd o arbrofi allai roi mwy o wybodaeth am y ffordd neu'r dull y mae cemegion yn adweithio â'r gell neu ag organau'r corff hwythau o fudd gwyddonol. Defnyddir y gell 0 linach sefydlog LS929, sy'n hannu o'r llygoden, ar gyfer y llu arbrofion in vitro sydd yn cael eu datblygu yn ein labordy yn Aberystwyth. Y bwriad gwreiddiol oedd datblygu prawf afyddai'n adlewyrchu'r hyn sy'n digwydd yn y prawf safonol in vivo (Draize). Prawf yw hwn lle y gosodir y gwenwynydd (e.e. siampw) ar lygaid cwningen ac yna mesur y difrod a wneir. Dech- reuwyd y gwaith tocsicolegol, ar gelloedd mewn potel, yn ein labordy yn y 1970au cynnar pan arbrofwyd gyda nifer o siampwau. Roedd y canlyniadau yn galonogol iawn gan i'r gwahanol siampwau wenwyno'r celloedd ar y raddfa o fod yn gymharol ddiniwed i fod yn niweidiol iawn. Ond yn bwysicach fyth roedd yr effeithiau'n dilyn yr un patrwn yn gywir â'r canlyniadau a gaed mewn adroddiadau eraill lle y defnyddid y prawf Draize. Er hynny, gan fod marwolaeth cell yn ddigwyddiad sydyn nid oedd y dechneg hon yn rhoi gwybodaeth am y dig- wyddiadau sydd yn arwain at farwolaeth. Oherwydd hynny, ni cheid unrhyw arwydd o'r modd y mae'r gwen- wyn yn adweithio gyda'r gell. Cyn cael gwybodaeth felly bu'n angenrheidiol dyfeisio arbrawf fyddai'n mesur vr effaith a geir ar y cemegion metabolig a gynhyrchir neu a ddefnyddir gan y gell. Cemegyn felly yw adenosin triffos- ffad (ATP) a gynhyrchir gan y gell ar gyfer storio ynni fel y medr ei ddefnyddio yn ôl y galw. Mesur lefelau ATP Mae'n bosib mesur lefelau ATP drwy ddefnyddio'r adwaith rhwng lwsiferin a lwsiferas ers i Glick (1977) buro'r ensym lwsiferas. Gwneir hyn drwy fesur y goleuni a gynhyrchir gan fod yr unedau o oleuni yn gwbl ddi- bynnol ar grynodiad yr ATP. Addaswyd y dechneg hon fel y bo'n bosibl erbyn hyn fesur crynodiad yr ATP mewn cyn lleied ag 104 o gelloedd. Yn yr adroddiad hwn ceisiwn roi braslun o'r math o dystiolaeth a geir, drwy fesur lefelau ATP, am effaith gwahanol gemegion ar gelloedd. Mae'r canlyniadau yn deillio o'r arbrofion a wnaed yn ddiweddar fel rhan o dreialon ar y cyd rhwng gwahanol labordai a noddwyd gan FRAME ('Fund for the Replacement of Animals in Medical Experiments') er mwyn pwyso a mesur gwerth y gwahanol dechnegau in vitro. Derbynia'r corff yma gymorth ariannol oddi wrth lawer o gwmnïau fferyllol yn ogystal ä'r llywodraeth. Yn yr arbrofion profwyd ugain o gemegion, yna dewiswyd chwech ohonynt ar gyfer cym- haru'r canlyniadau o'r gwahanol labordai, sef y chwe chemegyn yr adroddir amdanynt yma. Llun 1. Dosbarthu'r celloedd i'r tiwbiau ar gyfer mesur crynodiad yr ATP gyda'r luminomedr. Celloedd ffibroblast yw LS929 sydd wedi eu haddasu i dyfu fel daliant ac sy'n dwblu mewn nifer bob rhyw 23 awr. Meithrinir hwy mewn hylif pwrpasol sy'n cynnwys ychwanegolion megis serwm 110 ffoetal, L-glwtamin a'r gwrthfiotigau penisilin a streptomycin, mewn potel liter ar dymheredd o 37 °C a chedwir hwy mewn daliant drwy gymorth Vibromixer (Chemap, A. G., Mannedorf, Swis- tir) sydd yn gwneud defnydd o'r effaith Bernoulli (Ulrich a Moore, 1965). Is-feithrinir y celloedd bob yn eilddydd wedi iddynt luosogi i ddwysedd addas (Kemp et al, 1983). Defnyddir 50 ml o'r daliant ar gyfer yr arbrofion ac adnewyddir y botel feithrin gyda 50 ml o hylif ffres. Dosberthir 1 ml o'r daliant i fflasgiau bychain Erlenmeyer gan ychwanegu'r cemegyn i'w brofi, yna eu gosod ar ysgwydwr (90 troad y munud)gangadw'rtymhereddyn37°C. CedwirypH yn optimaidd trwy ddefnyddio byffer carbonad/bicarbonad gan gadw'r nwy uwchben yr hylif yn gymysgedd o 5% C02/9596 ag aer. Cyfrifir y nifer o gelloedd a laddwyd ar ben y pedair awr trwy ddefnyddio cyfuniad o'r staeniau fflwroleuol (Takasugi, 1971) flwresein deuasetat (Rotman a Paper- master, 1966) acethidiwm bromid (Edidin, 1970). Fflwr- oleua'r celloedd byw yn wyrdd a'r rhai marw yn goch pan ddisgleirir pelydrau uwchfioled arnynt. Cyfrifir y cell- oedd byw a marw gan ddefnyddio haemoseitomedr o dan feicroscop fflwroleuol (Zeiss). Trafodir y canlyn- iadau allan o leiafrif o chwe arbrawf gyda chymorth cyf- riíìadur (Apple IIE) i roi ffigurau CDso ar gyfer pob cemegyn. Mesurwyd yr ATP yn y celloedd trwy ddefnyddio'r adwaith lwsiferin-lwsiferas (DeLuca a McElroy, 1981). Rhyddheir yr ATP o'r celloedd drwy ychwanegu Picoex B i'r daliant, wedyn ychwanegir lwsferin-lwsiferas